RACE技術實驗原理

      RACE技術是采用PCR 技術由已知的部分cDNA 順序來擴增出完整cDNA5’和3’末端,是一種簡便而有效的方法, 又被稱為錨定 PCR (anchoredPCR)和單邊PCR(one2side PCR)。

3'RACE

利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準*鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1（gene specific primer，GSP）作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為下游引物，以cDNA*鏈為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因3' 末端的基因片

段擴增出來。

5'RACE

先利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo（dT）30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準*鏈cDNA.利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到*鏈的5'末端時自動加上3-5個（dC）殘基，退火后（dC）殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo（dG）通用接頭引物配對后，轉換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭（見Figure 2 ）。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作為上游引物，用一個基因特異引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作為下游引物，以SMART*鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5'末端的c基因 片段擴增出來。終，從2個有相互重疊序列的3'/ 5'-RACE產(chǎn)物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產(chǎn)物的3'和5'端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。

實驗流程：

1、總RNA提取以及cDNA反轉錄

2、根據(jù)已知序列設計引物，以cDNA模板進行擴增，驗證序列正確性

3、RACE 擴增，并測序，使用錨定PCR（AnchoredPCR）與巢式PCR（Nested PCR）相結合的方法，分別進行3'末端和5'末端RACE并對其產(chǎn)物進行測序

4、根據(jù)測序結果拼接目的基因全長cDNA序列

5、將RACE產(chǎn)物進行TA克隆用于后續(xù)研究（可根據(jù)客戶要求自行選擇）

服務優(yōu)勢

采用進口試劑,確保實驗準確性

較同類產(chǎn)品方法更快速，便捷

豐富的項目經(jīng)驗，超過500例的成功案例

提供全套的后續(xù)生物信息學分析服務（可根據(jù)客戶要求提供個性化分析服務）

服務流程

1、確認客戶提供的序列信息

2、評估RACE實驗可行性

3、確認樣本信息

4、根據(jù)客戶提供的信息設計好實驗方案，銷售做出報價合同

4、客戶確定無誤后簽訂《沃森生物-RACE檢測服務合同》，并簽字（或蓋章）

5、支付預付款，服務正式啟動

6、根據(jù)合同實驗方案開展實驗

8、實驗結束后，發(fā)送初步實驗報告

9、支付實驗尾款

10、提供詳細實驗報告，完成實驗項目

材料提交說明

實驗樣品

1、組織或者細胞：提供盡可能多的新鮮組織或細胞樣品(包括3個技術重復)，組織樣品不少于200 mg，細胞至少107個

2、RNA樣品：3’ RACE：Total RNA>15μg；5’ RACE：Total RNA>25μg（注：OD260/OD280在1.9-2.1之間，完整性好)

序列信息：

1、大于200bp的已知序列(請注明已知序列的5’ 端及3’ 端)：如果已知序列比較短，建議先進行3’ RACE再進行5’ RACE，以提高實驗的成功率

2、實驗數(shù)據(jù)和參考文獻：這將會幫助我們更好地理解您的實驗背景，有利于實驗的順利進行

結果交付

實驗結題報告：包括實驗步驟，引物信息，實驗過程 PCR產(chǎn)物照片，全長序列拼接結果；

測序原始數(shù)據(jù)：測序彩色波形圖、堿基序列圖；

實驗產(chǎn)物：引物、PCR產(chǎn)物、測序用質粒（限產(chǎn)生克隆測序的情況）。

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